认识膀胱细胞——单细胞水平比较Human和Mouse的不同

膀胱是哺乳动物贮尿的囊状器官。当膀胱细胞功能失调时，尿路系统的各种疾病纷至沓来。尿道感染是最普遍的细菌性感染，据报道，每年大约有10%的女性被感染，50%的女性在她们的一生中至少有一次感染。

膀胱过度活跃（OAB）、膀胱炎等疾病在世界范围内很普遍。膀胱癌是尿路系统最普遍的恶性肿瘤，泌尿系肿瘤致死率排名第二、十大常见肿瘤之一。

因此对膀胱细胞的综合了解，有助于探索涉及的疾病缘由。让我们从了解正常膀胱细胞着手，为探索相关恶性症状助力，同时，且看单细胞技术如何化为研究利器，用于科研！

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实验过程与质控

1样本制备和测序

Human Bladder Cell：3个膀胱组织样本，取自膀胱癌病人的正常组织，2个女性和1个男性，年龄为35-38。解离后的细胞活性达到86%-95%。

Mouse Bladder Cell: 10个野生型C57BL/6 老鼠细胞悬浮液混合到一起，细胞活力为82.5%，对悬浮液进行了2次取样。

文库制备及10X单细胞测序：通过10X微流控制备系统实现单细胞文库制备，再通过Hiseq Xten平台进行测序。

2基本数据质控

质控（Seurat）: 

CellRanger完成数据前期分析后，使用Seurat的MergeSeurat 分别对Human样本、Mouse样本进行合并。过滤掉少于200个基因及大于4000个基因的细胞，并同时过滤掉线粒体基因比例大于10%的细胞。

对细胞表达矩阵完成标准化后，将基因表达低于0.0125，及高于3的基因进行去除。

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单细胞转录组图谱鉴定

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Human膀胱细胞亚群鉴定

将获得的12,423个高质量细胞用于后续分析。根据每种类型的标记基因，共划分为16个clusters，细胞数变化范围从66到2237。

不同的亚群，细胞同质性存在差异。如cluster6中，每一个细胞top5基因的表达量都很高，而其它亚群不同细胞的top5基因的表达存在差异。通过亚群鉴定，在一些亚群中发现了新的标记基因，如PLA2G2A和IGFBP6 在 fibroblast1（cluster3）中高表达。

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间质性细胞（ICs）亚群鉴定及新发现

VIM是ICs的特异性标记，本研究中用于排除免疫细胞。

根据fibroblast标记基因S100A4、COL1A1和COL3A1，fibroblast划分为3大亚群，如fibroblast 3 表达VIM、COL1A1和COL3A1，但不表达S100A4（下图B）。

根据共表达ACTA2和VIM，而不表达S100A4 鉴定出myofibroblast （下图B）。鉴定了一种新的ICs，该亚群共表达ACTA2和S100A4。和其它亚群不同之处在于，其高表达ADRA2A，HRH2和AVPR1A，即ADRA2A+ICs（下图B）。

为了进一步解析5种ICs亚群，使用Seurat的FindMarkers分析表达特征。如fibroblast 1中CLEC3B、FSTL1、 IGFBP6和FBN1呈现高表达，fibroblast 2中APOD、SFRP2、CHRDL2和C7呈现高表达等，而新发现的ADRA2A+ICs特异性表达ADRA2A和HRH2（下图C）。

进一步解析新发现的ADRA2A+ICs，ADRA2A和HRH2只在该亚群中表达（下图A）。使用 IHC-P（免疫印迹），在Human膀胱组织中观察到ADRA2A和HRH2蛋白的表达（下图B和C）。

为了进一步确定新发现亚群是ICs，使用ICs特异性标记VIM，ADRA2A和HRH2，借助IF（免疫荧光），验证该亚群是ICs（下图D和E）。

科普-ADRA2A和HRH2：ADRA2A编码alpha2A肾上腺受体，该受体能结合到去甲肾上腺素和肾上腺素，有研究表明在大鼠膀胱刺激性诱导的收缩中，肾上腺受体刺激能够抑制该过程。HRH2编码H2组氨受体，能够结合到组胺以预警过敏反应。

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构建ICs的发育轨迹并挖掘与发育阶段相关的基因

使用Monocle2构建ICs的发育轨迹。结果表明，Fib 1在发育的起始阶段，Fib2紧随其后，Fib3在branch 1的发育末端，Myo和ADRA2A+ICs在branch2的两个发育末端（下图A和B）。

根据预测的发育轨迹，发现top6基因随着拟时间发育呈现出明显的表达模式（下图C）。

结合拟时间发育的表达模式，对top50基因进行了聚类，共划分为3大簇（下图D）。Cluster1基因在发育的起始阶段，其中SH3BGRL3，FN1和FSTL1呈现高表达；Cluster2基因在发育的过度阶段，APOD、C7和SFRP2呈现高表达；Cluster3基因在发育末端，其中AREG、LY6D和RGS5呈现高表达。

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膀胱上皮细胞亚群鉴定及新发现

根据标记基因的表达情况，上皮细胞划分为6类，basal cells 1，basal cells 2，intermediate cells 2，intermediate cells 2，TNNT1+epithelial cells和umbrella cells（下图A）。

上述细胞的基因表达虽然呈现相似的模式，但是它们之间一些基因的表达呈现出显著的差异。

比如KRT5和KRT13在basal cells 1中高表达；uroplakin家族成员 UPK1A、UPK1B、UPK2等在umbrella cells中高表达，而其在 intermediate cells中表达较低，且在basal cells 2中没有表达 （下图B）。

同时也鉴定出一种新的上皮细胞，即TNNT1+epithelial cells。该类型细胞特异性高表达TNNT1（下图C），且高表达上皮细胞标记基因KRT18和KRT19（下图D）。

TNNT1编码慢速骨骼肌蛋白，该蛋白在骨骼肌纤维中特异性表达。从未有报道TNNT1在上皮细胞中表达，为了进一步确认该类型上皮细胞确实特异性表达TNNT1，使用IHC-P进行确认，结果表明TNNT1确实在TNNT1+epithelial cells中 ，推测该类型细胞具备骨骼肌肌肉的特性。

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RNAVelocity分析揭示膀胱细胞发育进程

科普-RNA Velocity：通过剪切前后RNA丰度的变化来反映基因变化的速率，预测细胞发育的轨迹和方向。图例中矢量方向反映发育的方向，矢量长度反映了发育速率。

膀胱上皮细胞研究表明，发育进程从basal cells到intermediate cells，后到 umbrella cells和TNNT1+ epithelial cells （下图B）。

ICs的结果与Monocle2得到的结果相似，并揭示了一些特征，fibroblast 1有更长的速率矢量，有发育为fibroblast 2的倾向 （下图D）。有些fibroblast 2速率矢量箭头指向myofibroblast。

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Human和Mouse膀胱细胞的相同与差异

在研究人的膀胱功能时，Mouse模型有一定可靠性和相似性。Human膀胱细胞划分为16个亚群，那么Mouse膀胱细胞呈现怎样的划分？

Human膀胱细胞鉴定了新的亚群，即ADRA2A+ICs和TNNT1+epithelial cells，Mouse膀胱细胞是否也存在新型亚群？

01Mouse膀胱细胞亚群鉴定

此次有12,884个细胞用于亚群鉴定。根据与Human膀胱细胞同样的标记基因，共划分为15个clusters。

同MCA膀胱细胞数据（ 已发表的microwell-seq数据）进行相关性分析，相关性系数为0.905，但该数据集仅有2,498个细胞用于亚群鉴定（11个clusters），而本研究共有12,884个细胞，更具有代表性。

Human膀胱细胞亚群中没有neurone cells和dendritic cells，而Mouse膀胱细胞亚群中有。

02人、鼠膀胱细胞的异质性和同质性

分析Human和Mouse数据集中具有相同基因名的同源基因，皮尔逊相关系数达到0.846，但是也存在基因表达异质性，KRT15、GSTA4和WFDC2在Mouse中呈现高表达，而FABP4、TIMP1和S100A2在Human中高表达（下图A）。

相关性分析Mouse和Human膀胱细胞亚群，它们之间存在很好的相关性（下图B）。

Human和Mouse smooth muscle cells 相关性很高，达到0.837。但同时存在异质性，KRT15、GSTA4、RPI17和LY6D在Mouse中高表达，而ACTC1、TIMP1和CCL2在Human中高表达（下图C）。Human fibroblast 2和Mouse fibroblast 3相关性达到0.851，但同时存在异质性（下图D）。

其它一些细胞类型如basal cells、intermediate cells、umbrella cells、myofibroblast、monocytes和T cells存在较好相关性，而endothelial cells则相关性较低，在此不再赘述。

细胞角蛋白是上皮细胞的中间蛋白，在Human中有20多种亚型。通过分析Human和Mouse上皮细胞的角蛋白基因家族，获悉了它们同质性和异质性的表达（图E是Human上皮细胞角蛋白基因家族的表达，图F是Mouse）。

KRT13在Human basal cells和intermediate cells中高表达，但在所有的Mouse上皮细胞中均呈现低表达。KRT15在Mouse上皮细胞的表达显著高于Human上皮细胞。

ADRA2A+ICs亚群未在Mouse膀胱细胞观察到，ADRA2A和HRH2也检测不到表达， IHC-P（免疫印迹）结果呈现阴性。ADRA2A+ICs可能是Human膀胱细胞中特有的一类细胞。TNNT1+epithelial cells在Mouse膀胱细胞中观察到，单细胞转录组数据和IHC-P实验均支持。

通过上述学习，我们了解了正常组织膀胱细胞的单细胞转录组图谱，同时也获悉了Human和Mouse膀胱细胞的同质性和异质性。这将为后续研究有病变的膀胱组织提供一定的借鉴。

后期我们会带来膀胱癌症细胞的前世今生，同时该文章也可以作为单细胞研究的一个示例，从亚群划分和鉴定、亚群的进一步细分、细胞发育阶段的分析、及不同物种间的比较。

单细胞转录组是研究疾病和癌症一扇新的大门，相信随着单细胞研究的进一步深入，各种组学的单细胞水平也会进入细胞发育的世界，让我们拭目以待。

参考文献

Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse Bladders. Journal of the American Society of Nephrology. Yu Zhenyuan, Liao Jinling, Chen Yang, et al. (2019). 

作者：易之
审稿：童蒙
编辑：angelica